Merupakan satu teknik yang dibangunkan oleh EM Southern, untuk memindahkan DNA segment yang telah dicerai-ceraikan setelah elektroporesis dari gel agarose kepada kertas turas nitrocellulose melalui tindakan kapilari. Kemudiannya DNA segment yang dikehendaki di kesan oleh nukleik asid komplementari beradioaktif dan kedudukannya dikenalpasti melalui autoradiografi.
Teknik yang sama, yang dikenali sebagai northern blotting, diguna untuk mengesan RNA. Bagi mengesan protein, teknik yang hampir sama diaplikasikan iaitu yang dipanggil sebagai western blotting. [Blotting: pengeringan]
1. Enzyme restriksi digunakan untuk memotong untaian molekul berat DNA menjadi serpihan-serpihan yang lebih kecil.
2. Fragmen DNA yang kemudian dielektroforesis pada gel agarosa untuk memisahkan mereka dengan saiz.
3. Jika beberapa serpihan DNA lebih besar dari 15 kb, kemudian sebelum blotting, gel boleh diubati dengan asid, seperti HCl cair, yang depurinates serpihan DNA, yang melanggar DNA menjadi potongan-potongan yang lebih kecil, sehingga membolehkan pemindahan yang lebih efisien dari gel ke membran.
4. Jika pemindahan alkali yang digunakan, gel DNA ditempatkan ke dalam larutan alkali (biasanya mengandungi sodium hidroksida) untuk menukar sifat sesuatu benda DNA-double stranded. The denaturasi dalam lingkungan basa dapat meningkatkan pengikatan DNA bermuatan negatif ke membran bermuatan positif, memisahkan menjadi untai DNA tunggal untuk hibridisasi kemudian probe (lihat di bawah), dan menghancurkan setiap RNA sisa yang masih mungkin ada di dalam DNA . Pemilihan kaedah pemindahan alkali lebih neutral, bagaimanapun, sering empirik dan boleh mengakibatkan hasil setara. [Rujukan?]
5. Selembar nitroselulosa (atau, alternatif, nilon) membran ditempatkan di atas (atau ke bawah, bergantung pada arah pemindahan) gel. Tekanan diterapkan secara merata ke gel (baik menggunakan hisap, atau dengan meletakkan tumpukan tuala kertas dan berat di atas membran dan gel), untuk memastikan baik dan bahkan kenalan antara gel dan membran. Jika pemindahan oleh buffer isap SSC 20X digunakan untuk memastikan mati dan mencegah pengeringan gel. Buffer pemindahan oleh tindakan kapilari dari wilayah air yang tinggi potensi wilayah potensi air yang rendah (biasanya kertas penapis dan kertas tisu) dan kemudian digunakan untuk memindahkan DNA dari gel ke membran; pertukaran ion interaksi mengikat DNA ke membran kerana muatan negatif DNA dan muatan positif membran.
6. membran tersebut kemudian dipanggang dalam hampa udara atau ketuhar biasa pada 80 ° C selama 2 jam (keadaan standard; nitroselulosa atau membran nilon) atau terkena radiasi ultraviolet (nylon membran) secara kekal melampirkan DNA dipindahkan ke membran.
7. membran tersebut kemudian terkena hibridisasi probe-serpihan DNA tunggal dengan urutan tertentu yang keberadaannya di DNA target akan ditentukan. DNA probe tersebut akan diberi label sehingga dapat dikesan, biasanya dengan memasukkan penandaan keradioaktifan atau molekul dengan pewarna fluorescent atau berkromogen. Dalam beberapa kes, probe hibridisasi boleh dilakukan dari RNA, bukan DNA. Untuk memastikan spesifisitas pengikatan probe ke sampel DNA, hibridisasi kaedah yang paling umum digunakan salmon atau herring DNA sperma untuk menyekat daripada permukaan membran dan DNA target, dideionisasi formamida, dan detergen seperti SDS untuk mengurangkan non-khusus mengikat probe.
8. Setelah hibridisasi, probe kelebihan dicuci dari membran (biasanya menggunakan buffer SSC), dan pola hibridisasi divisualisasikan dalam filem X-ray oleh autoradiografi dalam kes probe radioaktif atau fluorescent, atau dengan pembangunan warna pada membran jika kaedah pengesanan berkromogen digunakan.
Referensi
1. Wikipedia
2. Guruatma "Ji" Khalsa. (2010, April 12). Mama Ji's Molecular Kitchen. ASU - Ask A Biologist. Retrieved November 25, 2010 from http://askabiologist.asu.edu/southern-blotting
Tiada ulasan:
Catat Ulasan